并调节非酒精性脂肪肝的标志物
作者
斯蒂芬尼·C·德·坎波斯·扎尼1,2,任王3,海伦·维达-席尔瓦1,2,罗宾·D·克拉格斯顿1,杰西卡·T·Y·尤1,2,4,马塞洛·A·莫里5,吴建平3以及陈凯瑟琳 B.1,2,3,*
1加拿大阿尔伯塔大学埃德蒙顿分校生理学系 T6G 2H7
2阿尔伯塔糖尿病研究所，阿尔伯塔大学埃德蒙顿，加拿大 T6G 2E1
3加拿大阿尔伯塔大学埃德蒙顿分校农业食品与营养科学系 T6G 1C9
4脂质分子与细胞生物学组，阿尔伯塔大学埃德蒙顿，加拿大 T6G 2H7
5巴西坎皮纳斯大学生物化学与组织生物学系，坎皮纳斯邮政信箱6109
*应致函作者。
代谢物 2023,13（2），174;https://doi.org/10.3390/metabo13020174
提交日期：2023年1月5日 / 修订日期：2023年1月16日 / 接受日期：2023年1月20日 / 发布时间：2023年1月24日
（本文属于“生物活性化合物对代谢综合征影响”特刊)
摘要
非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是代谢综合征的肝脏表现，是一种全球性健康问题。目前，NAFLD尚无药物治疗获批。天然健康产品，包括生物活性肽，有望帮助管理代谢综合征相关疾病，包括胰岛素抵抗和肥胖。本研究假设，蛋白衍生的生物活性肽QAMPFRVTEQE（肽2）能够改善全身性和局部白脂肪组织的胰岛素敏感性，从而预防高脂饮食诱发的高脂饮食导致的NAFLD病理特征加重，如脂滴大小和数量、炎症以及肝细胞肥大。与罗格列酮类似，肽2补充在高胰岛素-正常血糖夹锁期间改善了全身性胰岛素抵抗，增强了白色脂肪组织中的胰岛素信号传导，调节体外脂溶。在肝脏中，与高脂饮食喂养动物相比，补充肽2的动物表现出肝胆固醇积累（p < 0.05）和单个肝脂滴面积约减少50%（p = 0.09），并减少肝炎浸润（p < 0.05），而罗格列酮则加重了脂肪变。总之，肽2补充改善了胰岛素敏感性和肝脂变性，这与胰岛素致敏药物罗格列酮不同。
1. 引言
代谢综合征的病理生理学体现了肝脏和白色脂肪组织（WAT）等主要代谢器官之间的明显交叉作用。非酒精性脂肪肝病（NAFLD）影响全球25%的人口，并与肥胖、2型糖尿病（T2D）/胰岛素抵抗（IR）和血脂异常密切相关。所有这些疾病都是公共卫生关注点，并引发社会经济问题[1]。NAFLD中的肝脂变是由于底物（脂肪酸和碳水化合物）的可用性与肝脏正常处理脂肪的能力之间的失衡所致。在人类中，肝脏中非酯化脂肪酸（NEFA）的两个主要来源是WAT脂解和新生脂肪生成（DNL）[2]。DNL通过非脂质前体如葡萄糖或果糖产生脂肪酸，在IR状态下会增加[3]，在NAFLD中起重要作用[4]。NAFLD可能进展为非酒精性脂肪肝炎（NASH），其中存在炎症、纤维化和细胞损伤，随后发展为肝硬化，进一步发展为肝癌，增加肝移植需求[2]，严重影响生活质量。
生活方式干预（饮食和体育活动）能改善NAFLD，但目前尚无药物治疗获批用于NAFLD。包括硫氧二烯（过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARγ）激动剂，是胰岛素敏化剂）在内的多种药物，正在研究中用于减少肝脂肪变、炎症和纤维化的治疗[5,6]。然而，相关发现存在争议[7,8]。天然健康产品和功能性食品包括有助于代谢状况管理的潜在候选产品。食品来源的生物活性肽不仅具有营养价值，还能调节促进健康益处的生理过程[9]。生物活性肽的食物来源有很多，包括鸡蛋，这是一种普遍可得且可食用的蛋白质来源。
此前，我们的团队证明蛋白水解液（EWH）能缓解大鼠模型中的高血压[10]和胰岛素反应[11]，并模拟脂肪前细胞中的胰岛素作用[12]。此外，EWH中发现的特异肽IRW能改善啮齿动物的高血压[13]和IR[14]。另一种在EWH中鉴定的肽是QAMPFRVTEQE（又称肽2），它模仿胰岛素的作用，在前脂肪细胞培养中提升PPARγ蛋白丰度及其他脂肪生成标志[15]，但其体内疗效尚未确定。鉴于NAFLD需要新疗法以及胰岛素信号传导、WAT和肝脏之间的交互作用，我们旨在识别肽2饮食补充对代谢综合征表现（包括全身性胰岛素抑制、胰岛素WAT反应和NAFLD标志物）的具体影响，与噻唑啶二酮罗格列酮进行比较。我们假设肽2补充能改善全身和局部胰岛素敏感性，进而缓解与非酒精性肝脏病相关的病理细胞特征，从而调节葡萄糖和脂质代谢。
2. 材料与方法
2.1. 动物与饮食
方案1：本方案及部分先前干预试验结果已由我们团队发表[11]。简而言之，雄性斯普拉格道利（SD）大鼠（n = 48）被喂食高脂饮食（HFD）6周。随后，一半动物接受HFD+4% EWH，其余动物作为HFD对照组继续6周。第12周结束时，一半动物接受了腹腔内胰岛素注射（2 IU/公斤体重），以刺激胰岛素信号传导，随后使用一氧化碳进行安乐死2.饮食成分已在其他地方发表[11]，并根据宏量营养素和能量含量进行了匹配。本文报告了来自WAT组织的脂解途径数据;EWH处理后大鼠表型的完整描述已发表于其他文献[11]。
方案2：从加拿大查尔斯河购买的雄性C57BL/6只5周大老鼠，每笼4只，可自由取食和饮水，暴露于湿度和温度控制环境下，光暗时间为12：12，湿度和温度均可控（湿度60%，23摄氏度）。小鼠接受低脂饮食（LFD，10%千卡脂肪）或高脂饮食（HFD，45%千卡脂肪）6周。之后，高脂饮食动物被分为三组：仅HFD组、HFD + 肽2组（PEP2）和HFD + 罗格列酮组（ROSI），并继续各自的饮食8周。LFD动物继续接受LFD治疗8周。在安乐死前，总共14周后，小鼠要么接受腹腔内胰岛素注射（1.5 IU/kg BW），要么直接使用一氧化碳安乐死2，而部分小鼠在安乐死前接受了高胰岛素-安定血糖夹，采用氯胺酮。饮食组成见表S1。肽2以每日45 mg/Kg体重/日剂量混合于饮食中。肽2的特性见表1[15];由Genscript（美国新泽西州皮斯卡特韦）合成，化合物纯度97.9%，无末端修饰。肽2可溶于水、二甲基亚砜和磷酸盐缓冲盐水，浓度为≤10 mg/mL。Genscript提供的高效液相色谱和肽段的质谱见图S1。罗格列酮（Sigma-Aldrich，美国马萨诸塞州圣路易斯）以2.5 μmol/kg BW/天的剂量在饮用水中施用。
表1。肽2规格。
2.2. 体重、体成分与样本采集
小鼠每周称重一次。在第14周空腹条件下，按照制造商说明使用ECHO磁共振成像（ECHO MRI）测量体成分。通过心脏穿刺将血液收集到EDTA管中，血浆储存在−80°C，等待进一步分析。肝脏和WAT（腹膜后核（rWAT）、附睾体（eWAT）和腹股沟（iWAT））被采集、称重并迅速冷冻于液氮中。每种组织的样本被固定在福马林中，脱水后保存在石蜡块中以供组织学分析。
2.3. 脂肪组织器官培养
在组织采集过程中，采集了每块约100毫克的脂肪垫（iWAT、eWAT和rWAT），并用冷磷缓冲生理盐水+1%青霉素/链霉素（Gibco，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国）清洗，并保存在M199培养基中（Sigma-Aldrich，美国马萨诸塞州圣路易斯），并补充50 μU胰岛素（Sigma-Aldrich，美国马萨诸塞州圣路易斯，美国）、2.5 nM地塞米松（Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国）和1%青霉素/链霉素，在37°C的细胞培养箱中保存24小时。之后，培养基被新鲜M199替换，仅补充2.5%无脂肪酸牛血清白蛋白（MP Biomedicals，美国加州圣安娜）。每件作品都经过以下处理之一：无菌H2O或去甲肾上腺素（1微米，Sigma-Aldrich，美国马萨诸塞州圣路易斯）或去甲肾上腺素（1微米）+胰岛素（1 IU/mL），服用2小时。培养基在2小时后采集一小块，保持在−80°C以备后续甘油分析。
2.4. 前芽细胞培养
从小鼠腹股沟WAT（9 W）和棕色脂肪组织（9 B）提取的前置细胞如前所述进行培养和分化[16]。简要地，细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，直至融合。之后，细胞在DMEM中分化出含有20 nM胰岛素、1 nM三碘甲状腺原氨酸、0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤、1 μM地塞米松、0.125 mM吲哲美素和2.8 μM罗格列酮。由于我们希望比较肽2与罗格列酮在前腺细胞分化过程中的作用，我们对上述分化组合进行了如下修改：对照组（C）接受上述组合，C+PEP2组用上述组合加100微米肽2处理，阴性对照组（Rosi阴性组）未加罗格列酮，Rosi阴性+PEP2组未加罗格列酮但补充肽2（100μM）。
2.5. 高胰岛素-正常血糖组夹
正常血糖夹按前述方式进行[17,18]，但进行了以下调整：简短地，小鼠使用氯胺酮（90 mg/kg BW）和赛拉嗪（10 mg/kg BW）麻醉，并接受右颈静脉无菌导管输液以进行静脉输注。术后体重和每日饮食监测。3–4天后（以恢复术前体重的最低90%），小鼠空腹5小时，并接受高胰岛素-正常血糖钳，该中先灌注连续注入氚化葡萄糖（1 μCi bolus + 0.1 μCi输注;Perkin Elmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）在实验期间被维持以评估葡萄糖动力学。基础期结束后，通过连续注注胰岛素（3.0 mU/kg/min）启动高胰岛素-正常血糖夹120分钟，血浆葡萄糖水平维持在与基础期相似的正常血糖水平，使用10%葡萄糖溶液的可变输注。每10分钟采集血浆样本，测量葡萄糖浓度（Analox葡萄糖分析仪，美国加州亨廷顿海滩）及[3-3H]-葡萄糖特异活性。钳制结束后，小鼠通过颈静脉输注0.02毫升氯胺酮安乐死，随后进行斩首。
2.6. 口服葡萄糖耐量测试（OGTT）
排卵睾酮训练在第13周进行。简而言之，在夜间空腹后，口服葡萄糖团（1克/公斤体重）给小鼠，并在0、15、30、60、90和120分钟后用血糖计从尾静脉测量血糖（Contour Next，密西沙加，安大略省，加利福尼亚州）。OGTT在第14周进行。空腹4小时后，小鼠接受腹腔内胰岛素注射（0.75 U/Kg BW），血糖在0、15、30、60、90和120分钟后测量，如上所述。®
2.7. 肝脏甘油三酯与胆固醇含量
肝脏甘油三酯（TG）和胆固醇均通过约100毫克组织提取，如前所述[19]。简要地，组织被均匀化在1毫升氯化钠溶液中。共500 uL提取物与2毫升Folch溶液（氯仿：甲醇，2：1）混合，以3000×克转速离心10分钟，收集下相。样品在氮气下干燥，再用1毫升2%的TritonX-100溶液在氯仿中重新悬浮，再在氮气下干燥。干燥后的样品随后被重新置于ddH中2O，并保持在−20°C，直到进一步使用。使用商业套装（Infinity）测量了甘油三酯和胆固醇含量TM美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Scientific）。
2.8. PPARγ DNA 结合活性
核蛋白提取使用商业试剂盒（Active Motif Inc.，美国加州卡尔斯巴德）执行，按照制造商的冷冻组织说明进行，每次提取使用100毫克组织。通过TransAM评估了PPAR-γ DNA结合活性TMPPAR-γ试剂盒（Active Motif Inc.，美国加利福尼亚卡尔斯巴德），使用10微克/10微升核蛋白提取物，遵循制造商说明。
2.9. 等离子体生化分析
所有生化参数均在夜间空腹（14–16小时）并按照制造商说明使用以下商业试剂盒或试剂后评估：小鼠胰岛素ELISA（ALPCO，新罕布什尔州塞勒姆，美国）;NEFA和肝脏L型甘油三酯M比色测定（Wako Pure Chemical Industries Ltd.，美国弗吉尼亚州里士满）;脂联素和抗性素（中尺度发现）;非酯化脂肪酸，使用甘油无试剂作为标准（Sigma-Aldrich，美国马萨诸塞州圣路易斯）;丙氨酸转氨酶（ALT）（英国剑桥Abcam）。胰岛素抵抗稳态模型评估（HOMA-IR）采用公式计算：[空腹血糖（mmol/L）] ×[空腹胰岛素（μU/L）]/22.5]。
2.10. 蛋白质提取与西方印迹
除非另有说明，所有试剂均从Sigma-Aldrich（Sigma-Aldrich，美国马萨诸塞州圣路易斯）购买。肝组织通过组织均质剂在RIPA缓冲液中均质化（50 mM Tris HCL pH：8.0,150 mM NaCl，0.1% Triton X-100,0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS），并补充2 μg/mL的抑肽素（Calbiochem）、5 mM 氟化钠、5 mM 正颌苯甲酸钠和蛋白酶抑制剂组合（FastPrep-24，MP Biomedicals）。脂肪组织蛋白通过提取套件（AT-022，Invent biotechnologies，美国明尼苏达州普利茅斯）提取。裂解液储存在−80°C以备后续分析。蛋白质提取物如先前报道，通过SDS-PAGE 12%聚丙烯酰胺凝胶分离[11]，并在与荧光二级抗体（Li-cor Biosciences）共浸育1小时前，探测p-AKT（CS-4060S）、AKT（CS-9272）、PPARγ（Santa Cruz Biotechnology-7196）、AT2R（abcam92445）、p-HSL（CS-41265）、HSL（abcam45422）、p-PKA（CS-5661S或PKA，CS-58425），然后与荧光二级抗体（Li-cor Biosciences）在RT下潜伏1小时。图像使用Image Studio Lite软件（Li-cor Biosciences，美国内布拉斯加州林肯）。所有磷酸化蛋白带均归一化为对应的总蛋白。总蛋白归一化为®β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich A5441）。
2.11. 组织学
将肝或WAT的石蜡块切割成5微米切片，贴在玻片上。如前所述，进行了血木精和伊苏木素（H&E）染色[11]。纤维化评估使用Masson的三色染色套件（Sigma-Aldrich，美国马萨诸塞州圣路易斯）。脂肪细胞大小：使用显微镜20×物镜和Axion Vision 4.8软件拍摄每张切片10张随机显微镜图像（每只动物1张）。ImageJ软件的“自由手选”工具被用于测量脂肪细胞面积（毫米）2）组成300个单元或每个样本10张图像，以先获得者为准。肝脏形态特征分析：随机拍摄了20张显微镜图像（20×张，Axio Vision 4.8软件，每只小鼠n=3张），一名盲法分配的研究人员使用ImageJ软件的“自由选择”工具量化脂滴面积、细胞数和炎症灶（含>5个免疫细胞的簇）。每幅图像被划分为四个相等区域，左上象限（标准面积：88,884.66微米）2）被分析为整体图像的表示。就LD大小而言，大小LD类别没有明确的数值阈值。然而，根据文献，肝脂质积累分为三类：大囊泡性，其中一个较大的LD将细胞核移向侧面;大囊泡型，单个小LD未移位细胞核;真正的微囊性脂肪贮积，多个小型LD占据肝细胞，使其呈现泡沫状外观[20,21,22]。
2.12. 定量PCR（qPCR）
引物序列见表S2。肝脏RNA按照制造商说明使用QIAGEN RNeasy min plus套件提取，并如前所述[23]进行了以下修改：冷冻组织（50–100 mg）被溶解并均质化，使用1毫升三唑。在RT5分钟后，每毫升TRIzol加入0.2毫升氯仿。样本被剧烈摇晃并在RT培养3分钟，随后以12,000×克离心，温度为2–8°C，离心10分钟。收集上清液，并按照制造商的指示完成剩余步骤，直到获得RNA。RNA浓度和纯度通过纳米滴剂测量（Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆），cDNA合成则使用高容量cDNA RT试剂盒（Applied Biosystems，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）在ProFlex PCR系统热循环仪中每次反应取2微克RNA（Applied Biosystems，马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行。qPCR使用PerfeCTa SYBR Green SuperMix ROX（美国马萨诸塞州贝弗利Quantabio）在QuantStudie3机器（Applied Biosystems，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）中以β肌动蛋白为参考基因进行。
2.13. 统计分析
所有数据均以每幅图描述中±n小鼠的SEM均值表示。统计分析使用GraphPad Prism 7.0软件（GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥）完成。通过Shapiro–Wilk检验检测数据是否正态分布，并剔除所有发现的异常值。采用T检验比较LFD与HFD（以确定IR相关差异），单向方差分析用于比较HFD组（即HFD、PEP2和ROSI），以识别治疗效果。采用双因子方差分析比较AKT、PKA和HSL的胰岛素调控。当观察到显著主效应时，进行了Bonferroni或Dunn的事后检测以评估组间差异。p值≤0.05被视为统计学显著。
3. 结果
3.1. EHW对肥胖胰岛素抵抗大鼠WAT脂解途径的影响
此前我们表明，4%的EWH能改善大鼠的葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性，减少脂肪细胞体积，并增强PPARγ在WAT中的含量[11];因此，本文研究了其对WAT中脂解酶的影响。在eWAT中PPARγ DNA结合活性降低了4%的EWH（p < 0.01），但在rWAT中显著增加（p < 0.01）（图1A，B）。通过双因子方差分析对脂解作用关键酶的研究显示，rWAT p-PKA/PKA比值显著影响整体饮食（p< 0.05），p-HSL/HSL整体胰岛素效应显著（p < 0.05）。事后分析显示，尽管PKA的磷酸化变化无变化，但EHW处理的动物在腹腔内注射胰岛素后rWAT的p-HSL降低（p < 0.05）（见图1C，D）。rWAT中未观察到PKA总蛋白或HSL蛋白丰度的变化（见图S2）。在eWAT中，双因子方差分析显示p-PKA/PKA对整体饮食有显著影响（p < 0.05），而p-HSL/HSL则无整体效应。未观察到p-HSL或p-PKA（图1E，F）及总HSL（图S2）的变化。然而，EWH处理后，PKA总丰度减少了4%（见图S2）。血浆和WAT脂联素及抵抗蛋白浓度在各组间无显著差异（表2）。
图1。在斯普拉格Dawley大鼠喂食EWH6周后，WAT中的EWH效应（方案1）。PPARγ DNA结合活性在rWAT（A）和eWAT（B）中。数据以SEM平均±表示，并采用双尾t检验（n = 6–7）。rWAT（C，D）和eWAT（E，F）中PKA、p-PKA、HSL和p-HSL蛋白丰度。数据以SEM平均±表示，并采用双元方差分析（n = 3–4）。字母不同条表示p <0.05。EWH，蛋白水解液;PKA，蛋白激酶A;PPARγ，过氧化物酶体增殖激活受体γ;HSL，激素敏感脂肪酶;WAT，白色脂肪组织;rWAT，腹膜后WAT;eWAT，附睾WAT。
表2。施用HFD+4% EWH治疗的Sprague Dawley大鼠血浆、附睾和腹膜后脂肪组织中的抵抗蛋白和脂联素浓度为6周（方案1）。数据以SEM平均±表示，并采用双尾t检验（n = 6–7）进行分析。
基于4% EWH有望改善胰岛素介导的脂解抑制和激活PPARγ的指标，启动了一项针对4种EWH衍生纯化肽（肽1–4）的试验，这些肽在体外引发了PPARγ升高[15]。根据初步数据（n=12只/组），肽2（p< 0.05）改善了胰岛素耐量，且iWAT和rWAT权重低于HFD（见图S3），而肽1、3和4则未影响任何WAT depot重量。值得注意的是，肽2肝脏重量最低，ROSI肝脏重量最高。因此，进行了更多实验，重点关注肽2对红外表型和iWAT/rWAT脂质代谢的影响。
3.2. 肽2和罗格列酮在高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗小鼠中的效应
3.2.1. 食物摄入、体成分和组织重量
与HFD动物相比，任何组间的食物和水摄入量均无差异（见图S4A–D）。如预期，HFD组在6周高脂饮食后，其BW比LFD动物高（见表3），且存在葡萄糖不耐受（见图S5）。试验结束时，HFD组的BW和BW增益均高于LFD。所有高脂蛋白组的初始BW无异;然而，ROSI组在治疗3周后，体重增益率低于高脂蛋白组，导致最终体重下降。肽2补充与HFD相比，未影响最终体重或体重增益。体成分分析显示，只有LFD动物的脂肪质量%和瘦体重%高于HFD（表3）。
表3。肽2喂养试验结束时C57BL/6小鼠的体重、体成分和血浆特征（方案2）。数据以均值+SEM表示，采用双尾t检验（LFD×HFD）和单因子方差分析（HFD组）分析。同一行不同字母表示HFD组的p<0.05。# 表示 p < 0.05，^ 表示 p < 0.1，相较于高密度饮食。
与高脂肪饮食相比，LFD动物的三种脂肪垫质量均有所减少。ROSI组的rWAT质量低于高脂肪脱氧，而PEP2动物的rWAT质量介于ROSI组和高脂肪脱药组之间。eWAT和iWAT在所有HFD组之间并未发生变化。LFD组和HFD组的肝脏重量无显著差异。ROSI动物的肝脏比所有其他HFD组都重（见表3）。
3.2.2. 等离子体生化参数
空腹LFD动物的血糖浓度低于HFD，而HFD组间未见统计学差异。尽管LFD（p< 0.1）和ROSI组较高脂蛋白组显著下降，但两组间空腹血浆胰岛素浓度均无统计差异。此结果伴随LFD动物的HOMA-IR低于HFD，但HFD组间无差异。任何组间血浆脂质谱（NEFA和TG）均未见变化（表3）。
3.2.3. 葡萄糖稳态与全身性胰岛素敏感性
体内测试确认，第14周高脂饮食动物相较于高脂肪饮食动物存在葡萄糖不耐受（图2A，C），且ROSI组的葡萄糖耐受性优于高脂肪饮食组（图2B，C，右侧）。双因子方差分析显示，HFD组间治疗×时间相互作用显著（p < 0.0001）及饮食显著效应（p = 0.0437）。然而，尽管OGTT曲线和AUC发生变化，增量AUC在各组间无显著差异（见图2D）。这很可能是因为LFD组的空腹血糖浓度显著低于HFD（图2E，左侧）。在高胰岛素-正常血糖夹钳LFD期间，ROSI组和PEP2组的胰岛素敏感性均优于HFD（见图2F–I和图S6）。高胰岛素-正常血糖夹期间的血浆葡萄糖在各组间无显著差异（见图2F）。同样，钳制过程中血浆胰岛素含量无差异（见图2G），均验证了该方法。HFD组的IR表现为夹持期间较低的葡萄糖输注速率（GIR）（图2H，左）和更高的葡萄糖产出（图2I，左）。此外，GIR在PEP2和ROSI中均高于HFD（右图2H）。此外，PEP2组的葡萄糖产生低于高脂肪蛋白，而ROSI则显示出中间效应（图2I，右侧）。在比较基底与钳制葡萄糖产出时，PEP2组仅抑制葡萄糖产生，LFD组也出现类似模式（见图S6A）。胰岛素刺激的葡萄糖释放在LFD组和ROSI组中高于高脂蛋白组，尽管PEP2组在数值上也更高，但无显著性（见图S6B）。在PEP2和ROSI治疗后，胰岛素耐受性测试（见图S6C–I）确认了胰岛素敏感性的改善。
图2。在用肽2处理的小鼠中进行葡萄糖耐受测试和高胰岛素-正常血糖夹持（方案2）。（A，B）葡萄糖耐量测试（OGTT）、（C）曲线下的OGTT面积（AUC）、（D）OGTT增量AUC、（E）OGTT日夜间空腹血糖（n=11–12）。数据以SEM平均±表达，并采用双尾t检验（LFD与HFD）以及单向方差分析（或Kruskal-Wallis组，HFD组）或双因子方差分析（ANOVA）。在高胰岛素-正常血糖夹中：（F）血浆葡萄糖浓度;（G）血浆胰岛素;（H）葡萄糖输注速率，（I）葡萄糖产生。数据以 n = 4–7 的平均 ± SEM 表示，并采用双尾 t 检验（LFD vs. HFD）或单因子方位分析（HFD 组）。带有不同字母的条形表示p <0.05。* 和 # 表示 p < 0.05;** 表示 p < 0.01;表示 p < 0.0001。
3.2.4. 胰岛素对WAT的调节：脂解与AKT
从空腹HFD动物采集的组织在eWAT和iWAT中体外受去甲肾上腺素刺激的脂解作用受损（见图3A，B），而在rWAT组中，所有组均发生脂解刺激，尽管HFD的刺激强度较低（见图3C）。双因子饮食综合效应在rWAT和iWAT中显著（p< 0.05），但在eWAT中无显著变化。整体刺激效果在三种脂肪垫中均显著（p < 0.05）。有趣的是，eWAT中无一组显示胰岛素抑制脂解作用（见图3A），但高脂肪脱氧中胰岛素抑制的缺失被肽2在iWAT（见图3B）和rWAT（见图3C）中得以挽救。ROSI在iWAT中对脂解抑制进行了归一化（图3B），但在rWAT中则未实现（图3C）。由于只有rWAT和iWAT显示了对脂解作用的抑制，我们仅在这两种脂肪垫中研究了胰岛素对脂解途径的调控。rWAT和iWAT在胰岛素刺激后LFD、PEP2和ROSI中表现出增强的AKT磷酸化，但在HFD组中则无此现象，胰岛素在两种脂肪垫中均有整体效果，但iWAT仅在iWAT中对饮食整体有影响（图3D，E和图S7）。
图3. 经肽2处理的小鼠离体组织中白色脂肪组织（WAT）的脂解作用及蛋白激酶B（AKT）活化情况（方案2）。离体脂解实验数据如下：(A)外侧白色脂肪组织（eWAT，n=5–6）；(B)内侧白色脂肪组织（iWAT，n=5–6）；(C)腹膜后白色脂肪组织（rWAT，n=4–6）；(D)rWAT的磷酸化 AKT /总 AKT 比值（p- AKT / AKT ，n=6）；(E)iWAT的p- AKT / AKT 比值（n=6）。数据以均值±标准误表示，采用双因素方差分析（D，E）。不同字母及*号表3.2.5. PPARγ Activation, Adipocyte Size and Adipogenesis Markers
尽管PEP2组和ROSI组增加了40–50%，rWAT中PPARγ蛋白丰度未达到统计显著性（见图4A）。然而，LFD组和ROSI组的PPARγ活化较HFD增加，PEP2组则没有（见图4B）。图像分析显示，任何饮食组中脂肪细胞的平均大小或分布（分别见图4C和图S8）均无差异。在iWAT中，PPARγ总蛋白丰度在各组间相似（图4E），PPARγ激活率在组间无差异（见图4F）。LFD组脂肪细胞的平均体积小于HFD（见图4，左侧）。然而，HFD组之间没有变化（右图4G）。分布曲线显示较大脂肪细胞的比例下降（>0.017毫米）2）在LFD中与HFD的对比（见图S8）。脂肪生成标志物（包括脂连素、周脂蛋白-1、脂肪酸结合蛋白4和脂肪酸合成酶）在rWAT和iWAT中HFD组的蛋白质丰度相似（见图S8）。此外，我们测试了肽2在分化小鼠皮下（9W）和棕色（9B）脂肪垫前脂肪细胞分化过程中的作用。然而，在脂肪生成、脂溶、脂肪生成和WAT褐变方面未观察到显著效应（见图S9和S10）。
图4。在用肽2处理的小鼠组织中，后腹膜白色脂肪组织（rWAT）和腹股沟白色脂肪组织（iWAT）脂肪生成标志物（Protocol 2）。（A）rWAT中PPARγ蛋白丰度;（B） rWAT中的PPARγ DNA结合活性（n = 5–6）;（C）脂肪细胞在rWAT（n = 4）中的平均面积;（D） rWAT中的代表性图像;（E）iWAT中PPARγ蛋白丰度;（F） iWAT中的PPARγ DNA结合活性（n = 5–6）;（G） iWAT 中脂肪细胞的平均面积（n = 4）;（H） iWAT中的代表性图像。数据以±SEM均值表示，采用双尾t检验（LFD与HFD）及单元方差分析（HFD组）或Kruskal–Wallis（HFD组）进行分析。字母不同的条纹表示p <0.05。高脂饮食（HFD）;LFD，低脂饮食;rWAT，腹膜后WAT;eWAT，附睾WAT;iWAT，腹股沟WAT;PPARγ，过氧化物酶体增殖激活受体γ;ROSI，罗格列酮。
3.2.6. 肝脏特征
LD的形态学特征显示，LFD组与HFD组在总LD数量（图5A，左）和总LD面积（图5C，左）方面无差异，但LFD的个体LD面积较小30–40%（p = 0.09）（图5B，左）。在高脂饮食组中，尽管所有组的清醒节数量相近（图5A，右），ROSI的单个清醒节区域与高频产相近，且总清醒节区域有所增加（分别见图5B、C，右）。PEP2的单个断肢面积较ROSI小，且较HFD约小50%（p = 0.09）（图5B，右侧）。此外，PEP2的总LD面积比HFD小40–50%，尽管方差分析显示p = 0.0001，表明整体治疗效果，但两组之间未见统计差异（图5C，右侧，p = 0.2）。虽然统计学上不显著，但对图像的定性分析显示，大多数动物的肝脂明显较少（见图5G的第一、第二和第四面板），而少数则没有（第三面板，图5G）。这些差异也反映在分布曲线（图5D）中，该曲线强调了LD面积的右移以及50微米>LD更为丰富2在ROSI肝脏区域内。关于肝细胞大小，LFD与HFD无差异，但PEP2面积细胞数高于ROSI，表明肥大较少（图5E，右侧）。此外，PEP2和LFD的炎症灶较HFD少，ROSI则具有中间效应（图5F，右侧）。肝TG含量（见表3）与LD特征的差异得到了代表性图像的支持，我们在其中观察到LFD和PEP2组的LD较小，覆盖面积较少，炎症灶点存在减少，而ROSI的大部分图像则被LD覆盖（见图5G）。PEP2组肝胆固醇含量低于高脂蛋白组和红外桃酸组，但LFD组和高脂脂组无差异（见表3）。血浆ALT在HFD组间无显著差异，但LFD的血浆ALT浓度低于HFD动物（见表3）。胶原染色以识别纤维化，几乎所有样本中肝实质中均未发现胶原蛋白。然而，ROSI组的所有样本中，至少有1张图像存在薄弱胶原染色。LFD组的一个样本显示明显的胶原染色，归因于随机发现的纤维化（见表S3）。
图5。肝脏表征用肽2处理小鼠组织（协议2）。（A）总的LD数（n=6）;（B）平均个体LD面积（n = 6）;（C） LD覆盖的平均面积（n = 6）;（D）按大小计算的LD分布（n = 6）;（E）每个肝脏面积分析的细胞数（n = 6）;（F）每张图像的平均炎症焦点（n = 5–6）;（G）肝功能图像。数据以±SEM均值表示，采用双尾t检验（LFD与HFD）及单元方差分析（HFD组）或Kruskal–Wallis（HFD组）进行分析。箭头表示炎症灶。不同字母的条线表示 p < 0.05。LD，脂滴;高脂饮食（HFD）;LFD，低脂饮食;ROSI，罗格列酮。
3.2.7. 肝脏PPARγ和AT2R及胰岛素信号传导
所有组的肝脏PPARγ丰度相似（图6A）。有趣的是，PEP2组的血管紧张素II型2受体（AT2R）蛋白丰度增强了2倍（p < 0.05），相比HFD组（图6B，右侧）。
图6。肽2处理小鼠组织中肝蛋白丰度（协议2）。（A）PPARγ蛋白丰度，以及（B）AT2R。数据以 ± SEM 平均数表示，n = 5–6 只小鼠。数据通过双尾t检验（LFD与HFD）以及单向方差分析或Kruskal-Wallis（HFD组）进行分析。字母不同的条表示p <0.05。PPARγ，过氧化物酶体增殖激活受体γ;AT2R，血管紧张素II型受体。
3.2.8. 脂质代谢、炎症和纤维化基因
高脂蛋白组间PPPAR α（Ppara）、γ（Pparg）和γ2（Pparg2）的mRNA表达无显著差异（见图7A）。虽然促炎基因Tnfa在HFD组间无显著差异，但PEP2中纤维化标志物Col1a1（p = 0.055）较ROSI减少趋势（见图7B）。在分析的多个脂质代谢相关基因中，只有Mogat1表现出显著差异，PEP2组较HFD增加了3倍，ROSI增加了约1.5倍（见图7C）。编码LD相关蛋白或参与脂解的部分基因未见变化（见图7D）。LFD与HFD之间未观察到任何分析基因差异（见图S11）。
图7。从处理过肽2的小鼠组织中肝脏基因表达（协议2）。（A）过氧化物酶体增殖激活受体;（B）炎症和纤维化相关基因;（C）脂质代谢相关基因，（D）与LD相关的蛋白质和脂解相关基因。数据以HFD对照折叠变化的±SEM平均值表示（n=7–8），并采用单因子方差分析或Kruskal–Wallis检验。数据已归一化为β-肌动蛋白基因表达。字母不同的条纹表示p <0.05。清醒症，脂滴。
4. 讨论
非酒精性脂肪肝病、肥胖和2型糖尿病的患病率同步上升。事实上，由于肝脂肪变与代谢疾病之间的关系，有运动推动改变NAFLD诊断参数，并提议将名称更改为代谢相关脂肪肝病（MAFLD）[24];不过，我们选择了NAFLD作为缩写。生物活性肽有潜力帮助代谢疾病管理，因为它们可以调节生理过程[9]，无论是与药物治疗结合，还是作为新颖的独立方法，适用于无批准药物治疗的疾病，如非酒精性脂肪肝病（NAFLD）。本研究假设，肽2的饮食补充将改善全身和局部胰岛素阻抗，进而调节高脂蛋白诱导肥胖IR小鼠的非酒精性肝病特征。我们发现肽2：（1）在高胰岛素-正常血糖夹期间改善全身性IR;（2）在rWAT和iWAT中救出了胰岛素调控的脂解，尽管脂肪细胞大小或体重无变化;（3）减少肝脂积累，同时增加单酰甘油O-酰转移酶1（Mogat1）基因表达;以及（4）减少肝炎浸润。
EWH是一种生物活性肽的混合物，已被证明能改善啮齿动物的IR并缩小脂肪细胞体积[11]。本研究显示，补充EWH的rWAT动物中PPARγ激活增强，同时对rWAT中参与脂解的酶抑制反应更好，p-AKT也升高[11]。另一种可能是HFD降低了基础p-HSL/HSL比值，EWH恢复后观察到胰岛素抑制p-HSL。尽管如此，这些发现促使我们假设体内代谢改善是由于WAT中PPARγ的调节，类似于噻氧脂二烯的作用，该酶将诱导脂肪生成并促进更多胰岛素敏感性脂肪细胞的出现[25]，从而改善全身胰岛素敏感性。随后我们询问EWH混合物中是否有特定肽能调节PPARγ丰度，体外筛查显示少数肽能模拟胰岛素增强PPARγ的效果[15]，促使我们研究其体内效应。根据筛选结果（见图S3），潜力更高的肽是肽2，我们进一步评估了其在肥胖和红外小鼠中的效果，重点关注WAT和肝脏。
IR是T2D的关键特征，在NAFLD的发展中起着重要且多因素的作用[26]。WAT中的IR导致脂解抑制受损，从而增加输往肝脏的NEFA，而肝IR则抑制糖新生[26]。此前已有研究表明，卵源肽和水解物能改善啮齿动物的胰岛素敏感性[11,14,27]，但未评估肝脏组织与非肝脏组织的相对贡献。因此，我们首先研究了利用高胰岛素-正常血糖钳（作为该结果测量的金标准技术）补充肽2减少IR的潜力。我们观察到LFD、PEP2和ROSI组的IR低于HFD组。尽管罗格列酮（一种已知的胰岛素敏化剂）被预期能降低胰岛素抗性，但这是首个显示肽2膳食补充剂能改善胰岛素抗性，尽管葡萄糖耐受性或体重没有变化。此外，PEP2组和LFD组在夹持期间内源性葡萄糖生成的抑制较HFD更强，这与肝胰岛素敏感性较佳相符。这种IR的改善得到了LFD组HOMA-IR降低的支持，但尽管PEP2组HOMA-IR有所下降，但统计学上并不显著。肽2补充不仅改善了全身性胰岛素敏感性，WAT胰岛素信号传导也得到了挽救。胰岛素对脂解的正常调控预计将减少NEFA送达肝脏。综合来看，这些结果表明PEP2组全身性胰岛素敏感性的改善部分原因可能是由于脂肪溶解的激素调节得更好，导致WAT向非脂肪组织的脂质溢出减少。
随后我们询问了WAT胰岛素信号的改善是否与PPARγ激活有关。PPARγ调控脂肪生成，并在葡萄糖和脂质代谢中起重要作用。我们此前已证明肽2在脂肪细胞培养中增加了PPARγ蛋白[15]。然而，我们未见任何脂肪垫中PPARγ激活升高。此外，HFD组在小鼠衍生细胞前脂肪细胞分化过程中，脂肪生成标志物在WAT脂肪细胞大小或脂肪生成标志物整体上无变化，这一点也得到了证实。另一方面，我们观察到ROSI动物rWAT中PPARγ的激活增加。因此，肽2的作用与罗格列酮不同，支持PPARγ无关的作用机制。我们在此得出结论，肽2在至少在本研究所用模型中独立于PPARγ独立改善胰岛素信号传导;因此，还需要研究其他机制。
持续的努力旨在验证胰岛素敏化剂（如噻噻唑丁二烯）在治疗非酒精氟化病毒（NAFLD）中的应用。然而，相关发现存在争议，大多数益处均来自吡格列酮而非罗格列酮[7,8]。在啮齿动物中，罗格列酮根据肝脏PPARγ表达水平起双重作用[28]。例如，在肝脏表达PPARγ低的小鼠中，罗格列酮能防止脂质积累;而在PPARγ升高的肥胖小鼠中，罗格列酮则加重肝脂肪变[28]。事实上，PPARγ是使用罗格列酮治疗的高脂肪饮食诱导肥胖小鼠肝脂变性肝脂变的关键上调因子[29]。同样，本研究显示，ROSI组虽然对胰岛素更敏感，但肝重和TG含量高于高脂肪饮食，而PEP2并未加重高脂蛋白诱导的肝脂肪变。PPARγ主要表达于脂肪组织中，但也表达于肝脏[30]，其表达在高脂饮食动物的肝脏中增强[28,29]。与文献类似，我们的研究中HFD喂养倾向于增加肝脏Pparg2基因表达和蛋白质，而PEP2和ROSI均未影响Pparg或Pparg2 mRNA。然而，尽管不显著，我们观察到ROSI组肝脏PPARγ蛋白丰度相较HFD对照组增加的趋势。肽2补充并未使PPARγ蛋白丰度超过HFD诱导效应。虽然我们未测量肝脏PPARγ DNA结合活性，但结果表明肽2可能未直接激活肝脏PPARγ，表明其机制与罗格列酮存在差异。
在非酒精性脂肪肝病中，发展为NASH的特征是LD体积增大、肝细胞肥大和炎症[2,5]。令人惊讶的是，ROSI组表现出真正的微囊泡脂肪变与大囊泡脂肪变混合，而PEP2组和HFD组似乎存在大囊泡性脂肪变，后者被认为更具病理性[20,21,22]。然而，PEP2相比高脂肪蛋白（HFD）倾向于减少LD面积。因此，PEP2组表现出大囊泡脂肪变，LD较小;高脂泡组则为大囊泡脂肪变，LD较大。研究显示大囊泡性脂肪变与啮齿类动物的纤维化和微循环损伤相关[31,32]以及人类的纤维发生[20]，凸显了LD尺寸的重要性。此外，大囊性脂肪变的程度会影响人类肝移植和移植物存活率[21]。其他食物来源肽还能减少LD大小，例如胃蛋白酶产生的EWH补充剂能减少大鼠LD的数量和大小，同时降低血浆炎症和氧化应激标志物[33]。此外，补充甜羽扇豆肽（GPETAFLR）可改善肝脂肪变并降低TG含量。其作用机制被提出为PPARα和分离蛋白1（UCP1）激活，降低肝脏脂肪酸合酶基因（Fasn）和炎症标志物表达，但仅测量mRNA水平，未测量其活性[34]。另一项研究指出，补充马铃薯衍生肽（DIKTNKPVIF）后NAFLD的改善归因于腺苷单磷酸激活蛋白激酶（AMPK）的激活和炎症标志物的降低[35]。补充肽2后，Ppara或Fasn的基因表达未见变化。因此，PEP2补充调节肝脏LD体积的机制尚不明确。生物体重下降与非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的改善有关;在评估干预性研究时，是重要的混杂因素。然而，我们观察到肽2对LD尺寸的调节独立于BW变化。上述研究中，一项报告了相似的最终体重但eWAT质量较低[33]，另一项报告体重下降[34]，另一项未报告体重测量[35]。值得注意的是，有几种肽会减少肝脂的积累;然而，这究竟是蛋白质（氨基酸）相关还是肽特异性效应，仍有待确定。
肝脏形态的改善与肝TG含量无关，PEP2组与HFD组间无显著差异，但HFD组与PEP2组胆固醇含量下降，类似Song等人[36]，他们报告补充藜麦后肝脏总胆固醇含量下降，但HFD组与藜麦补充组在肝脂总胆固醇含量方面无显著差异[36] 并部分将非酒精性脂肪肝病的改善归因于肝脏磷脂的变化，如溶化石脂酰胆碱和泛酸的增加，以及磷脂酰胆碱和二油酰蝄啶胆碱的减少[36]。事实上，胆固醇代谢受损可能是导致大胆固醇形成的关键因素，而非TG代谢[20]。尽管ROSI组肝TG含量较高，血浆ALT无变化，显示除HFD外无进一步肝损伤。因此，除了LD的大小或含量，其脂质成分在引起肝损伤中也起着关键作用。
炎症和纤维化是评估NAFLD进展为NASH的重要标志。肽2补充降低了肝炎灶的密度，与母体EWH水解剂一致，降低了血浆炎症标志物。同一研究中，AT2R在WAT和肝脏中均有所增加[11]。此外，水解液通过调节肾素-血管紧张素系统（RAS）降低了大鼠的血压，包括降低血管紧张素II型受体并诱导大鼠主动脉中的AT2R丰度[10]。AT2R不仅通过抑制血管紧张素II型受体活性调节血压，其刺激还与肾上腺和心脏保护作用、抗炎和抗纤维化作用相关，正如其他文献中广泛综述的[37]。事实上，RAS调节与啮齿动物和人类非酒精性脂肪肝病患者的肝纤维化有关[38,39]。此外，AT2R在小鼠肝脏中具有抗纤维化作用[40]，并在血流调节中发挥作用[41,42]。当我们评估胶原染色作为纤维化的指示时，大多数样本中未发现胶原蛋白。这可能是因为14周45%高脂饮食不足以诱发明显的炎症和纤维化。尽管60%高脂饮食19周后Col1a1 mRNA有所增加，但仅在饮食干预50周时，组织学分析中出现纤维化[43]。考虑到大囊泡性脂肪变伴有较大的LD会损害肝血流[31]，以及我们发现PEP2在肝脏AT2R中表现最高、mRNA表达最低，我们推测AT2R上调可能是PEP2在NAFLD长期内减少炎症和纤维化的机制，但需进一步研究来证实这一推测。相反，ROSI不诱导AT2R或抑制胶原蛋白基因表达，使其肝脏效应与PEP2区分开来。
多种途径导致肝脂积累，包括WAT脂解后NEFA向肝脏的递送增加、脂肪酸氧化减少、DNL增加或VLDL分泌减少[2]。尽管肝脏中肝细胞在肝脏中表现出大和小LD的肝细胞之间存在葡萄糖和脂质代谢基因表达差异[44]，但令人惊讶的是，ROSI组和HFD组的mRNA表达模式相似。这并不排除ROSI在调节脂质代谢途径中的作用，因为我们未测量相关酶的活性。PEP2组与HFD组之间观察到的唯一差异是PEP2组中Mogat1基因表达更高。Mogat1编码甘露糖蛋白N-乙酰氨基氨基转移酶1（MGAT1），该酶通过单酰甘油O-酰基转移酶途径催化TG合成。MGAT1在肝脂肪变中的作用存在争议，一些研究表明沉默肝脏MGAT1可改善脂肪变性和血糖水平[45,46]。相反，也有研究表明，MGAT1在肝脏中敲除并未改善HFD喂养小鼠的肝脂肪变、肝TG含量、胰岛素敏感性或葡萄糖耐受[47]。此外，肝脏对MGAT1的过度表达在高脂饮食小鼠中不会增加肝TG含量，但在LFD动物中则会[47]。在我们对空腹动物的研究中，发现LD体积减小伴随着Mogat1基因表达升高，但没有其他PPARγ的直接靶点表达增加。有趣的是，肝脏Mogat1表达和MGAT活性的增加发生在长时间禁食且脂肪氧化较高后，且这些现象与Ppara表达无关，表明MGAT1调控肝脏空腹反应[48]。这与我们研究中发现的LD体积降低相符。我们未观察到Ppara基因表达改变，也未直接测量其活性，因此需要进一步研究以阐明肽2在肝脂代谢中的作用及其与MGAT1的关系。
由于我们计划使用罗格列酮作为胰岛素敏化和PPARγ激动的阳性对照，肝脏表型与PEP2的差异令人意外。我们的结果表明，与罗格列酮不同，肽2不激活PPARγ，且在高脂蛋白诱发的肥胖和胰岛素阻滞情况下，肽2不会加重高脂蛋白诱导的肝脂肪变。相反，肽2补充能改善IR，挽救WAT中的胰岛素调控脂解，同时减少LD面积，减少炎症，并可能预防纤维化，这些是防止NAFLD发展为NASH的关键过程。
我们注意到，含有45%千卡脂肪的高脂蛋白并不常用来生成NASH动物模型，大多数由饮食诱导的模型采用高脂高糖饮食。因此，我们模型中观察到的肝脏炎症和纤维化较现有文献更少[49,50]。肽是混合在动物饮食中服用的，因此无法精确指定每只动物所摄入的肽剂量。另一方面，这种饮食干预在慢性研究中相比每日食失在减轻动物压力方面有优势，因为压力会加重我们的主要结果是IR。需要注意的是，氧化应激也参与肝脂肪变性向NASH的进展，且如最近综述所述，多种食物来源肽具有抗氧化活性[51]。未来研究中，值得探讨肽2的抗氧化活性作为预防疾病进展的可能机制。此外，测试肽2的生物利用度和吸收途径，包括调控细胞连接蛋白的能力也很重要。最后，我们所有的数据都反映了夜间空腹状态，与进食状态相比，可能导致基因表达模式不同，部分结果的影响也较轻。
总之，本研究首次表明肽2饮食补充能改善高脂蛋白诱导肥胖和IR小鼠的IR，同时独立于BW防止HFD诱导NAFLD特征的进一步恶化。另一方面，尽管罗格列酮处理的小鼠胰岛素反应有所改善，但与高脂肪饮食联合使用时肝脂肪变更严重。因此，与罗格列酮相比，肽2对胰岛素抵抗、WAT功能障碍和肝脂肪变的综合结局有更积极的改善。
总结：
研究核心发现：
该研究证实，卵白蛋白来源的生物活性肽（Peptide 2，序列QAMPFRVTEQE）可：
· 减少肝脏胆固醇积聚（p < 0.05）
· 减少肝脏脂滴面积约50%（p = 0.09）
· 减少肝脏炎症浸润（p < 0.05）
· 改善胰岛素敏感性，减少肝脏脂肪变性
补充资料
以下支持信息可于以下网站下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/metabo13020174/s1，表S1：饮食成分;表S2：引物序列;表S3：纤维化评估;图S1：肽2的高效液相色谱和质谱;图S2：斯普拉格·道利WAT中的EWH效应;图S3：体内肽筛选时的组织重量和信息测试;图S4：食物和水摄入量;图S5：肽治疗前的OGTT;图S6：高胰岛素-正常血糖钳和ITT;图S7：脂肪组织总AKT和p-AKT;图S8：脂肪生成标志;图S9：PEP2对9W脂肪细胞前分化的影响;图S10：PEP2对9 B脂肪细胞前分化的影响;图S11：LFD组和HFD组的脂质代谢基因表达。
作者贡献
S.C.D.C.Z. 概念化;形式分析;调查;方法论;可视化;写作——原始草稿;写作——审阅与编辑。R.W.调查;写作——审阅与编辑。J.T.Y.Y.调查;方法论;写作——审阅与编辑。R.D.C.方法论;写作——审阅与编辑。J.W. 概念化;资金获取;方法论;写作——审阅与编辑。H.V.-S。调查。C.B.C. 概念化;资金获取;方法论;监督;写作——审阅与编辑。M.A.M.方法论;形式分析;写作——审阅与编辑。所有作者均已阅读并同意已出版的手稿版本。
资金
C.D.C.Z 曾或正在由阿尔伯塔糖尿病研究所（ADI）、阿尔伯塔大学和加拿大健康研究院（CIHR）资助。J.T.得到了加拿大健康研究院（CIHR;PJT-378765），加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC;RGPIN-2016-06657），加拿大创新基金会约翰·R·埃文斯领导基金（37267），同时是阿尔伯塔大学大脑代谢调节二级研究主席。J.W. 得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（RGPIN-2018-04680 和 NSERC CRDPJ 532150-18）以及加拿大蛋农协会的支持。RDC由CIHR（PJT 156226和169060）和NSERC（RGPIN-2017-04710）支持。资助来自阿尔伯塔卫生服务。M.A.M.由国家科学与技术发展委员会（CNPq）（310287/2018-9）和圣保罗州安帕罗基金会（FAPESP）（2021/08354-2及2017/01184-9）资助。
机构审查委员会声明
该动物研究方案已获得阿尔伯塔大学动物护理与使用委员会（协议#1472）批准，遵循加拿大动物护理委员会发布的指导方针。
知情同意声明
不适用。
数据可用性声明
数据包含在文章或补充材料中。
致谢
我们感谢Bryan Lum、Samantha Kinney和Henver Brunetta在夹具实验、qPCR和细胞培养实验中的专业协助。
利益冲突
作者声明不存在利益冲突。
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